賽默飛Lipofectamine 2000轉染試劑說明書及操作指南

賽默飛Lipofectamine 2000轉染試劑（貨號11668019）說明書及操作指南

一、產品概述

Lipofectamine 2000是賽默飛世爾研發的高效陽離子脂質體轉染試劑，適用于哺乳動物細胞的DNA、siRNA及CRISPR組件遞送。其采用脂質納米顆粒技術，在保證轉染效率的同時顯著降低細胞毒性，被廣泛應用于基因表達調控、RNA干擾及基因編輯研究。

二、核心參數

· 貨號：11668019

· 包裝規格：0.75 mL / 1.5 mL

· 適配樣本：DNA（質粒、PCR產物）、RNA（siRNA/miRNA/lncRNA）

· 推薦細胞類型：HEK293、HeLa、CHO、原代細胞等

· 儲存條件：4℃避光保存（嚴禁凍存）

· 有效期：未開封12個月，開封后6個月

三、標準操作流程（以6孔板為例）

1. 試劑配制

①稀釋液選擇：Opti-MEM®（貨號31985070）或同類型無血清培養基

②DNA稀釋：每孔2-4 μg DNA，用250 μL稀釋液混勻

③脂質體稀釋：按DNA用量1:2.5比例稀釋（如2 μg DNA需5 μL Lipofectamine 2000）

2. 復合物制備

①將DNA與脂質體稀釋液等體積混合

②室溫靜置15-20分鐘，形成乳白色復合物（顯微鏡下可見均勻納米顆粒）

3. 細胞處理

①轉染時細胞密度：70%-80%融合

②移除原培養基，加入1 mL含復合物的新鮮培養基

③37℃培養4-6小時后換液

四、關鍵注意事項

1. 細胞狀態要求

優先選用低傳代細胞（P5-P10），原代細胞建議預鋪ECM基質（如Matrigel®）

2. 血清干擾機制

DNA轉染可保留≤10%血清，RNA轉染需全程無血清（避免核酸酶降解）

3. 毒性控制

①貼壁細胞轉染時間≤6小時（超時存活率下降20%-30%）

②懸浮細胞建議采用分步換液法

五、跨場景應用案例

1. CRISPR/Cas9基因編輯體系構建

質粒配比：Cas9質粒（1 μg）: sgRNA（1.5 μg）

共轉染支持：可同步遞送熒光報告質粒（如pmCherry-C1）

效率驗證：轉染48小時后Western Blot檢測靶蛋白敲除效果（編輯效率≥80%）

2. siRNA沉默實驗優化

siRNA工作濃度：20-50 nM

復合物靜置時間：嚴格控制在20分鐘內（超時導致效率衰減≥15%）

結果檢測：qPCR驗證mRNA水平（建議設置GAPDH內參對照）

六、技術問題排查指南

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