逆轉錄酶怎么選？

　　逆轉錄酶(Reverse Transcriptase)是一種用于從RNA模板生成互補DNA(cDNA)的酶，是cDNA合成和RT-qPCR反應中的核心酶，其合成的cDNA可以直接作為PCR,qPCR，LAMP和測序等檢測的模板。那么你知道該如何選擇逆轉錄酶嗎？讓我們一起來看看吧！

　　一、逆轉錄酶活性

　　逆轉錄酶主要包括以下三種活性：

　　①逆轉錄活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合，生成DNA-RNA雜合雙鏈。

　　②RNase H活性：水解雜合雙鏈中的RNA，得到與RNA互補的DNA單鏈（cDNA）。

　　③DNA指導的DNA聚合酶活性：以cDNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成雙鏈DNA。

　　二、決定最佳逆轉錄酶的幾個關鍵重要特性

　　1.熱穩定性

　　耐高溫能力是cDNA合成的一個重要方面，因為高溫有助于使具有強二級結構和/或高GC含量的RNA變性，從而實現全長cDNA合成和更高產量。

　　野生型MMLV逆轉錄酶在37°C下表現最佳，而加工改造后的熱穩定性MMLV逆轉錄酶可以承受高達55°C的溫度，而不會對逆轉錄效率產生負面影響。

　　2.RNase H活性

　　RNase H(核糖核酸酶H)是一種切割并降解RNA-DNA雜交鏈中RNA鏈的酶，同時可以保持DNA鏈的完整。

　　如果逆轉錄酶的RNA酶H活性過高，則會導致RNA模板的過度降解，引起cDNA合成不完整或效率低下。具有低RNase H活性的逆轉錄酶可以最大限度地減少反應中RNA分子的非特異性降解，提高cDNA合成的特異性和保真度。

　　由于RNA模板在全長逆轉錄完成之前可能被降解，RNase H活性是長片段cDNA合成過程中需要規避的因素。RNase H活性還可能會與逆轉錄酶中的活性聚合酶競爭從而降低逆轉錄效率。為了更好地合成cDNA，通過在逆轉錄酶的RNase H結構域中引入突變，逆轉錄酶的RNase H活性降低甚至完q消除。這種突變常常可以增加長鏈cDNAs的產量，促進其合成。

　　3.持續合成能力

　　持續合成能力是指在酶的單個結合事件中摻入的核苷酸數量。持續合成能力強的逆轉錄酶可以在更短的反應時間內合成更長的cDNA鏈。大多數經過改造的逆轉錄酶具有更強的合成能力(比野生型MMLV逆轉錄酶高65倍)。

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