RNA提取的操作關(guān)鍵點在哪？

RNA是目前發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)生物功能zui豐富多樣的生物大分子，同時是DNA與蛋白質(zhì)信息傳遞的橋梁，因此完整RNA的提取和純化是功能基因組時代的重要手段。那么你知道RNA提取的關(guān)鍵點在哪嗎？讓我們一起來看看吧！

所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵：①樣品細胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性解離，釋放出RNA；③對RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白質(zhì)混合物中分離；⑤對于多糖含量高的樣品還要采取措施有效去除多糖雜質(zhì)。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。

RNA酶(RNase)，尤其是胰RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類。除細胞內(nèi)RNase以外，環(huán)境中灰塵、各種試驗器皿和試劑、人體的汁液以及唾液中均存在RNase。這類酶耐熱、耐酸、耐堿，如煮沸也不能使之wan全失活，蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時失活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。RNase 的活性不需要輔助因子，二價金屬離子螯合劑對它的活性無任何影響，故在提取RNA時，應(yīng)盡力減少RNA酶對RNA的降解作用。

創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境主要包括兩個方面的工作，即極力避免外源RNase的污染和盡力抑制內(nèi)源性RNase的活力。前者主要來源于操作者的手、實驗的器皿和試劑；后者主要來源于樣品的組織細胞。RNA提取應(yīng)在潔凈的環(huán)境中進行，戴口罩和手套操作，使用一次性無菌器具，玻璃器皿用0.1%二乙基焦碳酸鹽(diethyl procarbonate, DEPC) 按規(guī)定消毒，所用試劑也應(yīng)經(jīng)專門的消毒滅酶處理。內(nèi)源RNA酶則采用加入抑制劑及向提取液中加入可使所有蛋白質(zhì)變性的試劑：如異硫氰酸胍(GTC) 和F巰基乙醇，鹽酸胍，尿素，去污劑(十二烷酰肌氨酸鈉、SDS)，酚/氯仿，整個提取操作都在冰浴下(0~4℃) 操作。

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