NGS測序之文庫構建

一、文庫構建的步驟

文庫構建大致步驟類似，但是各有各自du特的點，例如，RNAseq里miRNA，lncRNA，mRNA方法各有差異，具體方法以后有機會再補充。這里以Illumina的 PE文庫為例，其流程圖如下圖。

二、文庫構建詳細步驟

（1）DNA片段化 （Fragment DNA）

使用超聲、酶或者加熱的方式將DNA樣品打碎成小片段，一般在300 ~ 800bp之間除非有特殊要求。

（2）末端修復（End Repair）

補平片段化時導致的不平末端。

（3）3' 末端加“A" （A-tailing）

3‘ 末端加A，轉換為粘性末端，與adapter 互補配對，因為adapter 3‘端有一個突出的T。

（4）接頭連接（ ligation adaptor）

這一步有兩種不同的添加策略如下圖。

左邊的圖是直接在fragment DNA的兩端直接加上full Y-adapter, adapter中已經包括了和P5/P7 oligo互補的序列, index, 以及Read1/Read2的測序引物。

右邊的圖是先在fragment DNA的兩端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互補配對的序列以及index序列，分兩步：

A. PE adapter添加利用堿基互補配對的原則，加上PE adapter。PE adpater中一部分是建庫PCR富集時候需要用的引物序列，另一部分是測序時需要用的引物。

B.PCR 添加 index，P5，P7

Index也稱barcode，用來區分不同樣本的文庫，因為測序儀一個lane產生數據量若干Gb，為了最da化利用測序儀，一次上機常會進行多個樣本文庫混合測序，在后續分析時，Index用來區分數據是來自哪個樣本。

      ● PCR富集目的片段

進行PCR擴增，循環數與投入的DNA量有關，使得文庫達到上機濃度。

● 擴增文庫大小質檢

使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測。

● 文庫濃度定量

Qubit3.0 進行初步定量 Q-PCR對文庫的有效濃度進行準確定量，至此文庫構建結束。

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