細(xì)胞轉(zhuǎn)染常見方法之原理、特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)步驟

隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，細(xì)胞轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。常用于研究基因功能、基因表達(dá)調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用非常廣泛。

目前實(shí)驗(yàn)室最為常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法有兩種：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法，接下去分別介紹這兩種方法的原理、特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)步驟。

一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

1. 原理

陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞（見下圖）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室最fang便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。

2. 特點(diǎn)

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的優(yōu)點(diǎn)是能夠高效轉(zhuǎn)染許多細(xì)胞系，適用于高通量篩選，并能夠遞送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外，該方法既可應(yīng)用于穩(wěn)定表達(dá)，也可應(yīng)用于瞬時(shí)表達(dá)，與其他化學(xué)方法不同的是，其可用于將 DNA 和 RNA 向動物和人體內(nèi)轉(zhuǎn)移；缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率依賴于細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件，因此，需要對每種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細(xì)胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜上→復(fù)合物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞→檢測基因表達(dá)或沉默情況。

二、電穿孔法

1. 原理

利用電脈沖可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的膜上小孔，同時(shí)細(xì)胞膜上電勢升高，驅(qū)使帶電荷的分子（如 DNA）以類似于電泳的方式經(jīng)臨時(shí)微孔穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)（見下圖）。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場強(qiáng)度會殺死50%-70% 的細(xì)胞。為確保轉(zhuǎn)染成功，針對實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)是極為重要的。電場強(qiáng)度、脈沖形狀、脈沖施加次數(shù)、緩沖液組分等因素都會影響轉(zhuǎn)染效率。

2. 特點(diǎn)

與其他轉(zhuǎn)染方法相比，電轉(zhuǎn)染具有諸多優(yōu)勢，其中主要優(yōu)勢包括：適用于所有細(xì)胞類型的瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；在確定最佳電轉(zhuǎn)染條件的情況下，能夠在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞。電轉(zhuǎn)的主要缺點(diǎn)在于高電壓脈沖可引起大量細(xì)胞死亡，僅部分細(xì)胞膜可以成功修復(fù)，因此相比化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，電轉(zhuǎn)染需要使用更多數(shù)量的細(xì)胞。

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞→對含有核酸，緩沖液，細(xì)胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細(xì)胞膜上形成電勢差，誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時(shí)的孔使核酸進(jìn)入細(xì)胞→將細(xì)胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測基因表達(dá)或沉默情況。

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