一抗和二抗如何選擇？

一、一抗的有關介紹

1. 概念

   一抗（primary antibody）作為一種免疫球蛋白，能夠特異性結合特定蛋白并將其純化、檢測和定量。使用小鼠、大鼠、山羊、兔子以及其他動物作為寄主，可將一抗培育成多克隆（pAb）或單克隆抗體（mAb）。
   

2. 實驗中的考慮因素

   （1）實驗種屬和類型的確定

         ※明確實驗中的樣本種屬：如人、鼠、兔等，應該選擇物種相同或有交叉反應的抗體。

         ※明確實驗類型：如WB、ELISA、IHC、ICC、FCM 分析等，一般抗體說明書會明確說明該抗體經試驗驗證適用或不適用于何種分析類型，如未提及也并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型，而是說明尚未經過此種分析試驗驗證。

   （2）抗體的類型

        ※單克隆抗體：由單一B淋巴細胞分泌產生的僅識別某一特定抗原表位的、高度均一的抗體。單抗實驗過程中可產生極少或無背景染色，同時也可減少與非目的蛋白的交叉反應。

        ※多克隆抗體：由多個B細胞克隆產生，針對于抗原幾個表位的多種抗體混合物。多抗可識別出抗原的微小變異，能產生更強大的抗原檢測信號，是涉及變性蛋白質實驗首xuan抗體。

3. 分析樣本蛋白的結構性質

   選擇最合適的抗體還需要分析了解樣本蛋白的結構性質，抗體說明書中也有相關免疫原的描述。如檢測的是蛋白片段或者特殊的同型物又或是蛋白全長的某一個區域，那么則必須選擇用含有此片段域的免疫原制備的抗體。
   

4. 抗體宿主物種的選擇

   一般在用偶聯的二抗結合無偶聯物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇就較為重要。對于IHC而言，應盡可能得選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而可以避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產生的交叉反應。比如：檢測小鼠樣本蛋白，則不要選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選擇兔源的一抗，那二抗則可選擇偶聯了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。

   如果選擇有偶聯物的一抗則不適用上述情況，除IHC外的其它不含內源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大。

二、二抗的有關介紹

1. 概念

   二抗（secondary antibody）可以直接和與靶抗原連接的一抗結合。在一抗與抗原結合后，標記的二抗特異性的結合一抗的Fc端。利用這種相互作用可以使二抗間接地進行檢測和純化靶蛋白（抗原）。
   

2. 實驗中的考慮因素

   （1）種屬來源
   

    一般會根據一抗的種屬來源來選擇相應的抗該物種的二抗。比如：一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則應該是抗小鼠的二抗（山羊或是兔抗小鼠）。

   （2）抗體亞型

         多克隆抗體一般主要是IgG類免疫球蛋白，相應的二抗為抗IgG抗體；單克隆抗體由于存在不同的亞型和類別，選擇二抗時需要根據一抗的類型或亞類相匹配。

   二抗又分為完整抗體和抗體片段兩種，根據實驗來決定使用哪種，主要包括IgG分子完整抗體、Fab片段以及F(ab’)2片段。

   tips:

      ※較小的抗體片段能夠更高效地滲透組織，有利于IHC及IF等實驗應用；

      ※采用抗體片段可以減少抗體Fc 部分與細胞上Fc受體之間的非特異性結合，可用于分析Fc受體含量高的特定組織（例如脾）。

   （3）種屬來源

         二抗的選擇還與偶聯的標記物有關系，二抗可以偶聯不同的標記物如酶、熒光素、生物素及同位素等，形成不同的標記抗體。

         偶聯物的選擇會對抗體靈敏度產生極大的影響；生物素偶聯物、聚合物的酶促偶聯物或熒光偶聯物有利于放大信號。