各種轉染試劑中文說明

一、PEI Prime Powder, Transfection Grade Linear Polyethylenimine(Serochem)轉染步驟（以 HEK293 貼壁細胞為例）

1.細胞接種：細胞密度 2-6 x106 cells/mL.

2.質粒的準備：在 5％最終培養體積的 DMEM 或培養基中，每 10 6 個細胞稀釋1.0 ug pDNA。

3. PEI 的準備：在 5％最終培養體積的 DMEM 或培養基中，每 10 6 個細胞稀釋3.0 ug PEI Prime，混勻通過快速，短暫渦旋或顛倒數次試管，將 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。

4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室溫下靜置 10 分鐘。一邊旋轉板，一邊將 pDNA 和 PEI 混合物逐漸滴加到細胞中。

5.于 37℃ CO₂ 培養箱中培養。

二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉染步驟：

說明：以下步驟適用于在 6 孔培養板中轉染貼壁細胞。開始時，每 6 孔培養板使用 0.4ug DNA。盡管 DNA 的量看起來很少，但已足夠用于轉染。如果想獲得最高的轉染效率，對每種細胞系的轉染條件都要進行優化。

轉染前一天，用 5ml 含血清和抗生素的培養基分裝使每 6 孔培養板含 2-8×105的細胞（根據細胞類型而定）。在細胞的正常培養條件下培養（通常 37℃和 5％CO2）。轉染當天細胞應 40-80％融合。轉染時，用 DNA 濃縮緩沖液（EC Buffer）稀釋 1ug DNA 至 100ul 總體積（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 濃度：0.1ug/ul）。加入 3.2ul Enhancer， 渦旋 1s 以混合溶液。

重要：請保持 DNA 與 Enhancer 比例恒定。

 注意：質粒 DNA 的質量會顯著影響幾個轉染參數如轉染效率、細胞增殖和細胞毒性、以及對于結果的解釋。因此，只應該使用最高純度的 DNA。室溫（15-25℃）孵育 2-5 分鐘，離心（spin down）幾秒鐘以從管頂去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent，反復吸取 5

次或渦旋 10 秒鐘以混合。

注意：沒必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室溫中放置 10-15 分鐘不會改變它的穩定性。

室溫下（15-25℃）孵育 5-10 分鐘以形成轉染復合物。孵育過程中，從培養板上輕柔地吸出培養液，用 4ml PBS 洗滌一次細胞。加入1.6ml 新鮮培養液（可以包含血清和抗生素）到細胞中。加入 0.6ml 培養液（可以包含血清和抗生素）至包含轉染轉染復合物的 EP 管中。吸取兩次以混合，立即將轉染復合物 drop-wise 加入 6 孔培養板的細胞中。輕搖培養板使轉染復合物分布均勻。將細胞與轉染復合物在它們的正常培養條件下孵育適當的時間直至轉染基因表達。孵育時間和由所采用的實驗和所使用的基因決定。

Optional: 大多數情況下，不需去除轉染復合物。然而，如果觀察到細胞毒性，則需在轉染后 6-18 小時移除 Effectene-DNA 混合物，用 PBS 洗滌一次細胞， 然后加入 5ml 新鮮細胞培養液。

瞬時轉染時，進一步試驗分析轉染基因的表達。

轉染β-gal 或 cat 報告基因的重組子常在轉染后孵育 24-48 小時以使轉染基因的表達。

穩定轉染時，在轉染后 24-48 小時，將細胞以 1:5~1:10 傳代至合適的選擇性培養基中。保持細胞在選擇性培養基中直至克隆出現。

注意：我們推薦對每一細胞系和使用的抗生素建立一個致死曲線（劑量-反應曲線）。但是一定要記住致死曲線受細胞密度的影響。

以下步驟有時是必須的：將轉染的細胞置于它們正常的培養液（如：不含選擇性抗生素的培養液），然后孵育 1-2 天，然后再加入選擇性培養液。