細胞轉染的一些事兒

轉染前準備：

材料：293T細胞（其他的細胞系種類）、MyoD表達質粒和EGFP表達質粒、DMEM培養基、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑（TransFast）

器材：20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭、酒精燈、廢液缸、血球計數板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺式離心機、35mm培養皿、轉染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD

1、細胞傳代培養：取出細胞群，去除培養基，使用PBS清洗2次。

用Tip頭加入1ml Trypsin液（胰蛋白酶），消化1分鐘（37。C，5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止。

加入1ml的含血清培養基終止反應。

用Tip頭多次吹吸，使細胞*分散開。

將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

用培養液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X106個細胞放入一個35mm培養皿。

將合適體積*培養液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。

將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染（當細胞密度達到50-80%時，可用于細胞轉染）。

轉染過程：

1）轉染試劑的準備

A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

3）將混合液在室溫放置10—15分鐘。

4）吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

5）加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

6）到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養基繼續培養24－48小時。

第二次細胞傳代

1）在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

2）再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新放入培養皿中。

3）在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。

篩選轉染細胞：

1．確定抗生素作用的理想濃度：

不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預試驗，確定抗生素對所選擇細胞的作用濃度。

1) 提前24 小時在96 孔板或24 孔板中接種細胞，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養過夜。

2) 將培養液換成含抗生素的培養基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。

3) 培養10-14 天以絕大部分細胞死亡濃度為準,一般為400-800μg/ml,篩選穩定表達克隆時可比該濃度適當提高一個級別，維持時使用篩選濃度的一半。最終得到和合適的抗生素濃度。

2．轉染按前面的步驟進行。

3．轉染72 小時后按1:10 的比例將轉染細胞在6 孔板中傳代，換為含預試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養基。在6 孔板內可見單個細胞，繼續培養可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。

1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細胞集落上10-15 秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于24 孔板中繼續加壓培養。細胞在24 孔板中長滿后轉入25cm 培養瓶中,長滿后再轉入75cm 培養瓶中培養。

2) 有限稀釋法：將細胞通過酶消化下來后做連續的10 倍稀釋（10^-2—10^-10），將每一稀釋度的細胞滴加到96 孔板中培養，7-10 天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。

4. ELISA 或Western blot 檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。