穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

本文主要介紹穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原理、步驟，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能夠得到穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，是滿足活性蛋白大量制備的方法。

利用哺乳動(dòng)物系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白，細(xì)胞的選擇培養(yǎng)也不可忽視。常用的有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）和人胚腎細(xì)胞（HEK293）。德泰生物主要培養(yǎng)HEK293用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，CHO細(xì)胞用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。針對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源基因在短時(shí)間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量少，1mg質(zhì)粒得到1mg蛋白，能夠滿足小量蛋白制備，大量生產(chǎn)成本很高。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身的基因組上，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂外源基因可以穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)經(jīng)過抗生素加壓篩選，終得到能夠穩(wěn)定表達(dá)蛋白的細(xì)胞株。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過程

1.細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細(xì)胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快復(fù)，防止在解凍過程中，產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟如下：

1）預(yù)先加熱水浴鍋，溫度37-40℃，并在離心管中準(zhǔn)備好10ml培養(yǎng)基

2）從液氮罐或冰箱中取出細(xì)胞，迅速放進(jìn)預(yù)熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動(dòng)，使其受熱均勻

3）當(dāng)凍存管內(nèi)*融化時(shí)，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有10ml培養(yǎng)基的離心管中

4）離心5min，去除上清，得到沉淀

5）用培養(yǎng)基懸浮沉淀，并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后，生長(zhǎng)一段時(shí)間，95%的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)良好，說明細(xì)胞復(fù)蘇成功。

2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

以Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑為例的操作流程，不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書

1）將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照1-3x10^5接種到6孔板中，加入2-4ml的*培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜

2）無(wú)菌狀態(tài)下配置如下溶液：a 用100ul的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2ug的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒

b 用100ul的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋25ul的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑（血清的存在會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，因此要使用無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染）

3）將ab溶液混合并搖勻，室溫下放置30min左右

4）細(xì)胞培養(yǎng)80%單層左右，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1ml的無(wú)血清培養(yǎng)基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)

5）將轉(zhuǎn)染液倒出，換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

3.穩(wěn)定細(xì)胞系篩選

24-72h加入選擇性抗生素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定抗生素的濃度，確定抗生素對(duì)所選細(xì)胞的低作用濃度。

1）提前一天接種細(xì)胞與24孔板中，待第二天長(zhǎng)成25%單層為宜，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。

2）第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）。

3）培養(yǎng)15天左右絕大多數(shù)細(xì)胞死亡抗生素濃度為準(zhǔn)，一般為400-800ug/ml，篩選細(xì)胞時(shí)刻適當(dāng)提高濃度

4）二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代，使用預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆，有限稀釋法挑取單克隆。

 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來(lái)做連續(xù)的10倍稀釋，每稀釋一梯度都在9孔板中培養(yǎng)，生長(zhǎng)一周左右再次挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)3次。

5）Western blot或ELISA檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，挑取多個(gè)單克隆進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，篩選出表達(dá)量的克隆傳代并保存。

終篩選出穩(wěn)定高表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，相對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建節(jié)約大量的時(shí)間和成本，是滿足活性蛋白大量制備的方法。